Enzo Castellari entame sa carrière cinématographique en tant qu’acteur ; il devient ensuite coordinateur de cascades et monteur, avant d’assurer la co-réalisation du western spaghetti Quelques dollars pour Django aux côtés de León Klimovsky en 1966.
L’année suivante, il réalise 7 Winchester for a Massacre, mais c’est avec Any Gun Can Play (1967) qu’il rencontre le succès pour la première fois. S’ensuivent alors Tuez-les tous et revenez seul !, Django Porte sa croix, and One dollar too many (1968) ou encore A Te Deum (1972). Dans les années 1970, il se tourne vers le polar d’action et signe les films cultes Le Témoin à abattre et Street Law (1974), avant de revenir au western spaghetti en 1976 avec Keoma – autre œuvre de référence. Le réalisateur a encore d’autres films cultes à son actif, dont Big Racket (1976), La Mort au Large (1981), Eagles Over London (1969) et The Inglorious Bastards (1978, Une poignée de salopards) qui a marqué Quentin Tarantino au point de s’en inspirer pour son propre film de guerre Inglourious Basterds.
L’incursion d’Enzo Castellari dans le cinéma fantastique se traduit par des films tels que Les Nouveaux Barbares (1983), Les Guerriers du Bronx (1983) et Sinbad (1989) produits par la Cannon.
Réputé pour ses fusillades tournées au ralenti et ses scènes d’action particulièrement intenses, qui lui ont valu le surnom de « Sam Peckinpah européen », il possède une filmographie aussi riche que variée dont le nom reste associé pour toujours à celui des autres maîtres du western et du polar à l’italienne.